四个情同手足的乌龟少年一直生活在人类城市隐秘的下水管道中，他们渴望成为这个城市的英雄，被人接受。在人类朋友爱普莉尔的帮助下，四位忍者神龟开始追踪一个神秘的犯罪集团，但随着一支强大变种生物军队的降临，同样属于变种生物的忍者…

该动画讲述的是由4只基因突变的乌龟所组成的忍者团体，并得到斯普林特师父的忍术训练和指导的故事。他们住在纽约曼哈顿的下水道，夜间出动，打击街头犯罪、邪恶势力和外星入侵，同时他们始终和外界社会保持距离。